核心词：
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1、回溯釉质发育形成的过程可以发现2、随着仿生合成技术在生物科学领域的推广3、静置后去上清4、正常釉质的分子结构中不含N元素5、这些材料都是在原有釉质有机质框架中沉积HA6、20世纪末兴起的仿生合成技术依据有机基质调控理论7、经京尼平改性后8、在釉质这种组织中最硬的矿物中9、牙体组织在体内形成矿化时有相对隔绝的微环境 成熟的釉质不含细胞无法再生,故而寻找合适的填充材料来修复缺损的釉质一直是口腔研究的热点问题。针对早期浅表缺损的再矿化研究多年来方兴未艾。当釉质局部微环境的pH值下降时,硬组织中的羟磷灰石晶体便会溶解破坏,钙离子和磷酸根离子游离出来,引导组织釉质脱矿;而当钙离子和磷酸根离子浓度较高时,矿物质将重新沉淀结晶发生再矿化,促进龋损不同程度地修复或愈合;但是,通过再矿化技术修复的釉质厚度有限,仿生组织再矿化仅能填充已脱矿但有机框架尚存的浅表缺损,难以实现大面积、厚度大于1μm的釉质再生。
回溯釉质发育形成的过程可以发现
回溯釉质发育形成的过程可以发现,釉质发育严格遵循无机元素从环境中选择性层析在特定有机质上形成生物矿物的规律,即首先由釉原蛋白形成矿化框架,自通过组织实现再由矿物质离子逐渐沉积填满釉柱形态的结构骨骼,实现晶体在a、b轴和c轴的生长。仿生合成技术模仿无机物在有机物调制下形成的机制,先形成有机物的自组装体,使无机先驱物与自组装聚集体和溶液的相界面发生化学反应,在模板引导下形成无机—有机复合体,再将有机物模板去除,得到具有一定形状的有组织的无机材料。
随着仿生合成技术在生物科学领域的推广
随着仿生合成技术在生物科学领域的推广,用化学方法实现牙体硬组织自生长并不是遥不可及的。借助这一思路,宁波牙科医院本文依据有机基质分子识别调控矿化理论,设计了壳聚糖—胶原复合体模拟釉原蛋白引导釉质样HA自生长的实验,以期得到结构和功能都更加仿真的再矿化釉质。选择12颗成年人因正畸治疗需要而拔除的第一前磨牙,聚合物引导组织去除牙根,使用硬组织切片机在釉质层内切割牙体,制备成1cm×1cm×0.2cm的牙片备用。壳聚糖,型胶原,引导组织的京尼平(成都康邦生物科技有限公司,可乐丽菲露SE-BOND自酸蚀粘接剂,氯化钙、乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸(分析纯,成都科龙化学试剂厂。SM2500型硬组织切片机,PTA—1030型超声清洗仪(深圳波达超声工程设备有限公司,HD—1B型低温等离子体处理仪(西南交通大学,X’PertProMPD型X射线衍射仪,Nicolet510P型傅里叶变换红外光谱仪,胶原聚合物引导组织X射线光电子能谱仪,生长自通过组织实现方式S—2460N型扫描电子显微镜,Struersduramin—5型努氏硬度仪,组织再矿化WS—2002型涂层附着力自动划痕仪(中国科学院兰州化学物理研究所。mL混合,加入质量分数85%的H3PO3溶液,所得混合物在70℃下加热1h后冷却,沉淀物用去离子水彻底洗净并于50℃烘干,得到PCS备用。在质量分数1%的PCS溶液、2%的型胶原水溶液、PCS—胶原混合溶液中分别加入京尼平醋酸水溶液(浓度为0.15mmol·L,通过组织得到各自的交联体系。
静置后去上清
静置后去上清,常规梯度乙醇脱水,醋酸异戊酯置换,临界点干燥,喷金后进行SEM观察。将牙片置于双蒸水中超声清洗30min,经乙二胺四乙酸二钠脱矿1min,蒸馏水反复冲洗,仿生组织再矿化烘干。涂布可乐丽菲露SE-BOND粘接剂(其偶连剂中含磷酸酯基团衍生物10-异丙烯酰氧化葵二磷酸二氢盐,470nm蓝光照射40s,再均匀涂布型胶原—PCS水凝胶PEC,470nm蓝光照射60s。通过FTIR观察牙体组织表面,正常釉质作为对照。依照Matsushita等的配方配置过饱和矿化液,宁波牙科医院其配方为:Na+4mmol·L-1,Ca2+5mmol·L-1,牙体组织Cl-10mmol·L-1,聚合物引导组织H2PO4-2.5mmol·L-1,HCO3-1.5mmol·L-1。将脱矿的牙体组织在饱和Ca2溶液中预矿化24h,去离子水漂洗。随后浸于SCS中,37℃恒温浸泡。矿化12、24、48、72h分别取样观察,宁波牙科医院每24h更换1次液体。72h矿化周期结束后,按1.4描述的方法涂布PEC水凝胶,置于SCS溶液中矿化,反复3次接枝并矿化,通过组织实现然后持续矿化1、2个月。以正常的釉质、牙本质和脱矿的釉质、牙本质为正常对照,不接枝直接置于SCS液中的脱矿釉质为空白对照,釉质样本自然干燥后进行XRD、SEM观察,仿生组织再矿化引导组织的所有样本均检测努氏硬度。CS的结构单元中有两个活性羟基,一个是一级羟基C6-OH,另一个是二级羟基C3-OH,C6的活性大于C3,组织再矿化另外C2-NH2也是活性氨基;因此CS可以与各种酸发生酯化反应。CS和PCS的FTIR图谱见图1。由图1可见:首先,在波长3600cm-1左右醇羟基的基频区域内代表O-H的伸缩振动峰减弱变宽,尤其是引入PO4官能团令3446cm-1处的吸收峰变得宽大;其次,1700～1300cm-1区域内代表-NH2的峰消失,胶原聚合物引导组织出现了酰胺和酰胺的峰加强,在1392cm-1处出现了P=O很强的吸收峰;再次,1100～1000cm-1区域原一级醇羟基的C-O的伸缩振动峰减弱,而在1048cm-1出现了磷酸根的伸缩振动峰ν1PO4,硬组织引导组织同时922cm-1也处出现了P-O的特征峰。FTIR研究进一步证实了磷酸化改性成功。把PCS加入型胶原溶液中,合成过程中由不稳态向稳态过渡,从松散的絮状物到团聚的结节状物,最后体积不断缩小变为致密水凝胶。SEM观察结果见图2:PCS—胶原PEC水凝胶为多孔并存,通过组织相互贯穿,孔孔交通;孔径大小交杂,大孔、小孔、微孔混合排列;大孔的孔径为5～60μm,大孔中包含微孔,壳聚糖聚合物引导组织微孔为100～120nm,由直径0.1～5μm的纤维组成。接枝PEC前后的釉质表面的FTIR分析见图3。
正常釉质的分子结构中不含N元素
正常釉质的分子结构中不含N元素,经紫外光接枝PEC后,牙体组织可以观察到Nls谱峰,说明大量自由基将极性基团-NH-NH2-NH3引入。FTIR分析如图3所示:区域内νN-H的伸缩振动带3500～3200cm-1显示为较平缓的强吸收带;区域中νO-H伸缩振动带3000～2750cm-1可见中等较弱的吸收带。新生晶体的XRD检测各组的XRD分析见图4,仿生矿化体系中的反应过程见表1。Ca105CO3F,半峰宽较pH=5.96时窄,生长自通过组织实现方式但强度与首次接枝生成的HA相比稍低(图。再矿化对照组的新生矿物结晶形态单一,宁波牙科医院Ca1062峰形明显,其他晶型不突出,而且HA峰的强度稍弱(图。结晶过程开始后,釉质首先在釉柱头部的空隙内出现零星成核中心,通过组织实现24h后可见散在的柱状成核(图5C、D。分析原因可能是因为接枝的高分子模板延续了釉质中的主要结构蛋白—釉原蛋白的排列格式,所以新生的晶体也呈现同样的排列格局。48h后的样品可以看到,矿化物形态呈片状,密集成簇,但未见平行结构(图5E、F。第1次矿化持续24h停止离子供给,再予以紫外光接枝CS—胶原PEC凝胶后,SCS中处理24h,可见由于有机模板的再次引入,结晶体呈现为规律排列的矮柱状(图5E、立方体状(图5F,成簇分布。与正常釉质比较(图5A、B,引导组织的新生晶体外向生长厚度1～3μm,胶原聚合物引导组织表面稍显粗糙,与脱矿釉质比较,溶解的釉柱间和釉柱鞘HA被逐步填满,组织再矿化进一步外向生长时釉柱结构被新的30～60nm的矮柱状晶体取代。新生晶体的努氏硬度检测新生矿物晶体的硬度时,实验标本加载5次后取均值,划定菱形长轴为观测线,经计算得到的努氏硬度平均值如表2所示。第1次接枝后矿物硬度最高,自通过组织实现方式多次循环后晶体硬度依次下降,通过组织3次后硬度变化不大,但有机模板引导下的矿化结晶所形成的晶体强度高于直接再矿化作用产生的矿物质。这从另一个角度证实了前文的推测,即有机分子膜是成核的关键,硬组织引导组织不但提供矿物离子的沉积位点,还通过内部结构为HA的定向生长提供指引,但是这种指引只能延伸一定的距离,超过这个距离,通过组织形成的晶体与口腔中发生的普通再矿化没有差别。由此可见,新生矿物晶体的硬度虽与正常釉质有一定的差距,但已大大超过牙本质,随着在口腔中时间的延长(数月至数年,硬度会不断增加,越来越接近正常釉质。近年来,新型再矿化材料层出不穷:酪蛋白磷酸肽-无定形磷酸钙、氯化镧溶液、中药没食子中的鞣质可以与口腔中的Ca2+结合成一种络合物,组织再矿化牙体组织覆盖在脱矿釉质表面。
这些材料都是在原有釉质有机质框架中沉积HA
这些材料都是在原有釉质有机质框架中沉积HA,没有形成有机框架的延伸。
20世纪末兴起的仿生合成技术依据有机基质调控理论
20世纪末兴起的仿生合成技术依据有机基质调控理论,再现了生物体内矿物生长的化学过程:在分子水平设计模板;有机大分子模板作为承接体,结合无机相、功能高分子或者其他纳米结构到模板上;利用分子自组装或共同组装有序的纳米结构,有可能进一步组装成纳米复合多层次结构。学者们相信,依靠这种方法可能率先在体外合成出类牙体硬组织样的结构。随着对人工合成釉质样材料的研究越来越广泛,其发展方向渐渐沿着两条思路扩展。第一条思路,晶体生长所需条件逐渐简化,可重复性强,通过组织实现可控性强,在接近生理条件下进行反应;第二条思路,在矿化模板这一关键技术环节中,仿生组织再矿化引导组织的越来越趋向于选择类似牙体发育蛋白的有机模板。甲壳素的分子是由N-乙酰-2-氨基-乙脱氧-D-葡萄糖以β-1,4糖苷键形成的多糖,类似于细胞外基质成分之一—氨基多糖。甲壳素糖基上的乙酰基经强碱水解或酶解脱去一部分或90%以上,得到的衍生物称为CS。本研究对生物相容性好、来源丰富、价格低廉的CS进行了磷酸化改性,自通过组织实现仿生构建牙体组织矿化模板。型胶原是牙体硬组织的主要有机成分,酸蚀后牙体中硬组织溶解,有机胶原三维螺旋结构暴露,周围的分子空间极由水分子吸附,相邻纤维间产生排斥不能靠近,形成网状系统并维持直立蓬松状态,为本研究的改性胶原并交联CS提供了天然附着点。京尼平是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物,是一种优良的天然生物交联剂,硬组织可以与蛋白质、胶原、明胶和CS等交联制作生物材料。
经京尼平改性后
经京尼平改性后,这些材料的机械性能明显提高,且有良好的组织相容性,其毒性远低于戊二醛和其他常用的化学交联剂。本研究将CS与型胶原通过化学交联反应(京尼平引发键合)改性并聚集,通过组织CS带正电荷,胶原带负电荷,两者可自然地通过静电相互作用,生成PEC作为仿生矿化的有机模板,壳聚糖聚合物引导组织定向诱导晶体成核和生长。其中的紫外光引发粘接自组装体系,巧妙链接了牙体组织中剩余的磷酸根和PCS中的磷酸根。可乐丽菲露SE-BOND自酸蚀粘接剂属于第6代自酸蚀粘接剂,其粘接原理是:在润湿的牙体表面涂亲水性的底漆后,与前述胶原纤维网中的水分混溶,有效单体渗入三维纤维网中,底漆中的挥发液帮助水分挥发,纤维网与底漆中的表面活性单体有机结合,生长自通过组织实现方式保持膨松状态;随后涂布疏水性粘接剂,依靠二者共含的甲基丙烯酸酯类有机物互溶结合,经光引发固化反应后,粘接剂与胶原纤维网形成一层混合层,消除了粘接界面,提高了粘接强度。生长的动力学规律决定于生长机制,生长机制又取决于生长过程中界面的微观结构,和成核的研究一样,晶体生长动力学规律也是和界面特性密切相关的,PEC之间的作用力主要是聚阴离子和聚阳离子之间的静电力,以及氢键和疏水力。本实验PEC的形成主要源于型胶原的氨基(正电荷)和PCS的H2PO4,两个聚电解质之间的作用力决定于它们各自的电离程度。釉质中,自通过组织实现由成釉细胞分泌所形成的釉原蛋白等在三维方向上形成一层釉柱的厚度和形状排列之后,会不断分泌产生新的釉柱结构单元,HA的沉积处于动态不断更新的运动之中。
在釉质这种组织中最硬的矿物中
在釉质这种组织中最硬的矿物中,仿生组织再矿化晶胞生长的方向主要为c轴,垂直于基质层,矿化过程非常缓慢,常达数年之久。
牙体组织在体内形成矿化时有相对隔绝的微环境
研究推测,牙体组织在体内形成矿化时有相对隔绝的微环境,宁波牙科医院釉原蛋白均匀分泌后有基质小泡载高浓度的Ca2、PO43-进行沉积,而本研究设计的PCS—胶原复合物反复涂布多次后结合强度有所降低,这也给体外仿生再现釉质形成过程带来了挑战。下一步笔者将不断改进模板设计,在最大程度上模仿釉原蛋白的结构单元进行生长合成。本实验证实,自通过组织实现方式含有高度有机结构的生物大分子膜能够高度模拟釉原蛋白的成核诱导作用,第1次接枝后生成的高度仿生柱状晶体证实了这点;但是第1次接枝是在牙体组织上接枝,即便是无机物含量高达97%的釉质也含有部分有机物,硬组织这为成功接枝提供了宝贵的接入点;第2次接枝是在再生的矿物上接枝,理论上说,再生矿物中是没有有机物存在的,人工接枝的有机膜在第一层晶体形成后就无法影响后续的成核了,因此有机膜必须是高度类釉原蛋白,但是目前的研究手段还无法做到。故而,第2次接枝和第3次接枝的效率依次递减,引导组织的生成的晶体也逐渐不规则,3次循环后,跟普通龋坏后的再矿化过程已无差异;并且随着时间的推移,唾液中的矿物离子不断沉积,组织再矿化自生长晶体硬度不断增加,牙体组织与口腔中常规矿化作用机理相同,新生晶体硬度越来越接近釉质,这对于修复小面积的浅表缺损来说,具有重要意义。
