核心词：
宁波牙科医院 体外成 牙环境成影响 环境成影响 对成影响 牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化 和牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚 牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚 间充质干细胞对成影响分化 充质干细胞对成影响分化 对成影响分化 对成影响的 成影响 目录：
1、结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC2、现有研究表明在不同的诱导条件下干细胞有向不同细胞分化的潜能3、免疫组化染色图像分析结果也表明3d后共培养组与TGC单独培养组DSP表达有差异4、出生后4d5、同一类型或不同类型的细胞通过旁分泌可溶性细胞因子或直接接触而相互作用6、在发育过程中 共培养组ALP活性高。
结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC
结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后,能够诱导细胞向成牙本质细胞分化,和牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚EMSC分化能力高于DPSC。牙胚细胞;牙髓干细胞;外胚间充质干细胞;细胞分化Q254A10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.005成体干细胞的增殖和分化离不开特定的微环境,微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体,与干细胞相互作用,控制干细胞的更新和分化。
现有研究表明在不同的诱导条件下干细胞有向不同细胞分化的潜能
现有研究表明在不同的诱导条件下干细胞有向不同细胞分化的潜能,从而将其作为种子细胞参与组织的损伤与修复。牙髓干细胞、外胚间充质干细胞都属于牙源性的间充质干细胞,对成影响体外成它们在一定成牙诱导环境中的细胞表型及功能变化,对于组织工程化牙齿构建中种子细胞的筛选具有重要的意义。本研究利用出生后4d的大鼠牙胚细胞作为诱导成牙环境,间充质干细胞对成影响分化牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化将DPSC、EMSC与其共培养,观察DPSC、EMSC对牙本质特异性蛋白牙本质涎蛋白的表达及碱性磷酸酶活性的变化,观察DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力,为今后组织工程化牙齿的构建提供有益的探索。材料和方法实验材料K-SFM无血清培养液、表皮生长因子、牛垂体提取物、抗角蛋白多克隆抗体,25g·L-1Brdu,抗Brdu单克隆抗体(武汉博士德公司,抗牙本质涎蛋白多克隆抗体,对成影响分化牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚荧光二抗:异硫氰酸荧光素标记的山羊抗鼠IgG、罗丹明标记的山羊抗兔IgG,激光扫描共聚焦显微细胞仪(奥林巴斯公司,日本,宁波牙科医院ALP试方法组织块酶解法培养TGC在体视显微镜下,分离出SD仔鼠(出生4d)下颌骨第一磨牙牙胚(组织块为1mm,绞碎后放入37℃PBS缓冲液中,型胶原酶和Dispase消化,成影响分离碎屑,充质干细胞对成影响分化离心后用无血清K-SFM培养液洗涤1次,离心并用含0.15ng·mL-1EGF、25μg·mL-1BPE的K-SFM无血清培养液将其制成细胞悬液,牙环境成影响转入培养瓶中,37、5%CO2孵箱中培养,每日换液。用细胞角蛋白多克隆抗体染色进行鉴定。DPSC和EMSC的BrdU标记及鉴定将DPSC和EMSC分别接种于6孔板内,板内预先放置细胞爬片,当细胞铺满瓶底60%时,对成影响的加入BrdU溶液分别孵育48h。取出玻片,PBS冲洗,体外成4%多聚甲醛液固定30min,然后进行免疫组化染色鉴定。TGC与DPSC、EMSC直接接触共培养根据预实验结果,将标记好的DPSC、EMSC分别与牙胚细胞以1∶1的比例混合接种于6孔板内。免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原DSP的表达取共培养1、3、7d的细胞进行免疫荧光双标检测,采用共聚焦显微镜进行观察。分别以546nm和490nm波长的激发光观察切片TRITC和FITC所标示的抗原;阴性对照采用一抗添加PBS。每张爬片随机选取8～10个不同的视野,分别计数每个视野内的细胞数及标记细胞的DSP阳性细胞数,对成影响分化计算各个视野阳性细胞数与细胞总数的比值,取其均值,环境成影响即为细胞的转化率。图像分析将免疫组化结果进行图像分析,宁波牙科医院检测DSP的表达变化。应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统,将染色的细胞爬片在镜下统一放大3.3×40倍,选取3张爬片,每张爬片随机选取不相重叠的5个视野,成影响用鼠标描绘所测细胞胞浆区域,计算机自动进行测量,获得每张爬片的胞浆平均灰度值,牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化牙环境成影响并对所测数据进行统计分析。ALP活性检测和染色将DPSC、EMSC分别与牙胚细胞以1∶1的比例混合接种于96孔板内,分别于培养后1、3、7d后弃去培养基,和牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚依照ALP试剂盒操作说明检测ALP活性。统计学处理采用SPSS10.0统计软件对数据进行分析,所有数据以x±s表示,多组均数比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。结果TGC的形态学观察和鉴定培养3～4d后,细胞从小的组织块爬出,对成影响部分细胞为椭圆、圆球型,胞浆丰富,胞核呈圆形,居中,有似铺路石样上皮细胞,连成片状簇状生长。周边有大量呈多角形或梭形的成纤维样间充质细胞生长(图。行细胞角蛋白多克隆抗体染色后,部分细胞显示红色荧光(图。免疫组化染色显示大部分细胞胞核阳性着色,和牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚标记成功(图。共培养组细胞的形态学观察共培养后的细胞形态变化不明显,环境成影响DPSC共培养组部分细胞有一侧胞浆突起;EMSC共培养组细胞呈梭形,对成影响分化为成纤维样形态。DPSC和EMSC与TGC间有比较明显的界限,细胞间未见融合现象(图。共培养组细胞DSP抗原的表达荧光共聚焦显微镜下观察可见,在绿色荧光激发下,体外DPSC和EMSC共培养组在3、7d后,都出现部分细胞核呈现绿色荧光;在红色荧光激发下,部分细胞胞浆呈红色着色。二者可表达于同一个细胞(图5。共培养1、3、7d后,牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化DPSC共培养组DSP阳性细胞的转化率分别为1.01±0.14、12.63±0.16、23.56±0.19;EMSC共培养组DSP阳性细共培养7d后,EMSC共培养组转化率较高。免疫组化染色和图像分析结果共培养后不同时间点两组细胞均有阳性细胞,胞核未着色,胞浆呈棕黄色。共培养1d时,牙环境成影响EMSC共培养组阳性细胞数量与TGC单独培养组差异不大,7d时部分细胞呈阳性。共培养1d时,对成影响分化DPSC共培养组只有少数细胞呈弱阳性或阴性,3d时细胞为阴性或弱阳性,7d时阳性细胞增多(图。由表1可见,对成影响的共培养1d后,3组细胞中DSP的阳性表达都较低,对成影响3d后共培养组与TGC单独培养组有差异,但是7d后差异有统计学意义,DPSC共培养组和EMSC共培养组间差异无统计学意义。ALP活性检测结果共培养3、7d后,ALP活性明显增高,EMSC共培养组较DPSC共培养组ALP活性高(表。讨论本实验利用组织块酶解法将SD大鼠牙胚组织进行混合培养,观察到部分细胞呈现上皮样细胞形态,呈椭圆形或圆球型。大部分细胞呈现成纤维样细胞形态,和牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚呈梭形或不规则的多角形。免疫荧光显示部分细胞对于上皮细胞的表面标志角蛋白染色阳性,环境成影响表明混合培养的细胞中包含有上皮细胞的成分。BrdU用于标记增殖分裂的细胞,其主要优点是BrdU抗体与BrdU反应后显色可即刻显现标记的情况。本研究利用BrdU标记共培养的DPSC和EMSC,免疫组化结果表明大部分细胞核呈黄染;将干细胞与牙胚细胞1∶1混合培养后,在荧光显微镜绿色荧光激发下有胞核呈绿色荧光的细胞,这表明这些细胞是共培养体系中标记BrdU的DPSC、EMSC。共培养体系中胞核呈绿色荧光的DPSC、EMSC在显微镜下观察到有部分细胞胞浆呈现红色荧光,表明在共培养体系中,DPSC、EMSC表达牙本质特异性蛋白DSP抗原。在单独培养的TGC中,间充质干细胞对成影响分化牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化DPSC、EMSC是不表达DSP的。
免疫组化染色图像分析结果也表明3d后共培养组与TGC单独培养组DSP表达有差异
免疫组化染色图像分析结果也表明3d后共培养组与TGC单独培养组DSP表达有差异,7d后差异显着。牙齿的发育是一个复杂而又连续的过程,已经发现约50多种基因参与牙胚发育过程中的上皮-间充质间的信号调控。由于成牙的微环境十分复杂,涉及到各种基质成分、矿物离子和生长因子等,因此诱导微环境的创造在组织工程中的作用日益受到重视。Young等将猪磨牙牙胚分离为单细胞悬液后与支架复合,移植于无胸腺大鼠大网膜内,观察到牙冠结构的形成。将六龄猪第三磨牙的釉质器和间充质酶解分离形成的单细胞悬液植入胶原海绵,牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚对成影响也观察到釉质和牙骨质样物。这些研究说明牙发育的信息,如位置、形态等调控的信息可能是存储在单个细胞中的,牙胚中的牙源性上皮细胞和间充质细胞可以在体外培养液中共同生长,通过细胞之间的相互作用并分泌信号分子,这种强大的诱导因素可以促进细胞游走,诱导牙齿不同组织细胞按发育要求进行重新组合并形成相应组织。提示TGC分泌的信号因子有可能成为牙齿组织工程良好的诱导微环境。Duailibi等证实出生后4d获得的鼠磨牙牙蕾细胞对于组织工程的构建是最佳的。
出生后4d
出生后4d,自然形成的鼠磨牙处于帽状期,充质干细胞对成影响分化开始呈现细胞的分化,和牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚分离后的细胞在体外可以持续培养6d。因此本组选用出生后4d的大鼠TGC作为成牙诱导的微环境。
同一类型或不同类型的细胞通过旁分泌可溶性细胞因子或直接接触而相互作用
同一类型或不同类型的细胞通过旁分泌可溶性细胞因子或直接接触而相互作用,这种作用是维持正常组织器官及细胞功能和结构的重要调节因素。骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞或皮肤成纤维细胞直接接触培养可以诱导其形态和表型发生变化。学者将DPSC与成釉细胞共培养,能够促进成釉细胞分化和釉基质沉积。BMSC与牙周膜来源的细胞共培养,BMSC获得了牙细胞融合是目前关于干细胞是否具有横向分化能力争论的焦点。学者认为BMSC在体内通过与心肌细胞融合而获得心肌细胞特征性的标志,并非发生了横向分化,但细胞融合的发生率约为0.0002～0.0011。本研究中DPSC、EMSC与TGC共培养,细胞表达DSP阳性的转化率远高于细胞融合的几率,间充质干细胞对成影响分化无法单纯用融合来解释。
在发育过程中
在发育过程中,牙乳头细胞通过上皮和间充质间的作用,体外成可以分化为成牙本质细胞,但是釉质上皮细胞影响间充质细胞分化的机制不清楚,ALP是成牙本质细胞分化的标志,成牙本质细胞比牙源性的未分化的间充质细胞显示更高的ALP活性。Shiba等分离培养了兔切牙的牙源性上皮细胞和牙髓细胞,它们的ALP活性很低。共培养后,对成影响分化牙髓细胞的ALP活性上调。本研究结果也表明在TGC的诱导下,共培养组细胞的ALP活性增高。其中3、7d组EMSC共培养组的ALP活性要高于DPSC共培养组,宁波牙科医院提示在体外成牙环境的诱导下EMSC分化能力要高于DPSC。体外培养的TGC可能仍存储成牙的信息和诱导间充质细胞的分化信息,本研究尝试性地将混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境,牙髓干细胞间充质干细胞对成影响分化外胚观察到TGC与牙源性的间充质细胞DPSC、EMSC共培养后,能诱导细胞分化,表达成牙本质细胞的特异性蛋白DSP,成影响充质干细胞对成影响分化成牙本质细胞分化的标志ALP的活性也增高。但由于时间所限,未对不同时期和不同的培养方法进行进一步探讨,如能筛选出体外培养的最佳诱导微环境,牙环境成影响将为组织工程化牙齿的构建提供新的思路。
