核心词：宁波牙科医院 HIV 感染者 口腔 牙周 致病菌 情况 分析 
　　PCR检测疑似口腔牙周病原体PCR反应的第一步:根据Siqueira等人报告的方法,16SrRNA细菌通用引物序列的设计（见表,由上海盛工生物工程技术服务有限公司合成。见图1~图7。研究表明,HIV感染者牙周病变的微生物特征比健康牙周组织更复杂,一些微生物组合仅在HIV感染者中发现在HIV感染者的龈沟液中经常检测到更常见的机会微生物群,这可能是由于免疫抑制促进非典型病原体的沉降和增殖,因此了解HIV感染者龈下区域的不同微生物特征很重要。本研究旨在通过聚合酶链反应检测HIV阳性患者口腔中六种常见的牙周可疑病原体,并分析其影响因素。
　　1、共有66例HIV感染者前往昆明市第三人民医院第一感染科接受治疗
　　一般数据纳入标准:2011年8月至9月,共有66名HIV感染者前往昆明市第三人民医院第一感染科就诊,宁波牙科医院其中44例无haart3,2例有haart3。健康对照组:2011年8月至9月到昆明延安医院体检的32人,HIV阴性,年龄、性别与患者组基本匹配。牙周病的发生通常被认为取决于宿主和现有口腔定植微生物群之间的相互作用。其中,阳性对照为昆明医科大学附属口腔医院张明珠博士保存的6株国际参考标准菌株,阴性对照为去离子水。其目的是检测通用引物的通用性和特异性引物的特异性。
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　从右到左:dnamarker、阳性对照、阴性对照和8个样本,用于提取DNA扩增产物。
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　从右到左:dnamarker、阳性对照、阴性对照和8个样本,用于提取DNA扩增产物。
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　从右到左:dnamarker、阳性对照、阴性对照和8个样本,用于提取DNA扩增产物。根据吸烟和饮酒的程度对三组进行分级,并分析吸烟和饮酒是否影响六种细菌的分布。统计分析表明,轻、中、重度吸烟者中间支原体检出率差异有统计学意义,其他五种细菌与吸烟程度无显著关系。
　　8、不同样本中相同细菌的检出率没有显著差异
　　然而,不同样本中相同细菌的检出率差异不大,无统计学意义。从表中可以看出,虽然在不同的样品中检测到不同的细菌,但各种细菌的检出率差别很大。
　　9、检出率最高的是连翘木霉（约98%）
　　检出率最高的是连翘木霉（约98%）,最低的是放线菌（仅3.06%）。在三组人的不同口腔标本中检测出六种疑似牙周病原体。在所有收集的唾液和龈沟液中检测到的六种细菌如表2所示。饮酒对6种细菌的检出率影响不大,无统计学意义。
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　从右到左:dnamarker、阳性对照、阴性对照和8个样本,用于提取DNA扩增产物。
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　2、提取DNA扩增产物的8个样本
　　从右到左:dnamarker、阳性对照、阴性对照和8个样本,用于提取DNA扩增产物。从右至左:dnamarker、阳性对照、阴性对照和8个样本提取DNA扩增产物。不同CD4细胞计数与六种牙周可疑病原体检出率的关系。AB组HIV感染者分为两组≥500、201~499和≤根据CD4细胞计数水平为200。分析6种细菌检出率与CD4T细胞计数的关系。统计分析显示,两者之间没有统计学差异。从右至左:dnamarker、阳性对照、阴性对照和8个样本提取DNA扩增产物。图1从一些龈沟液中提取的细菌16SrDNA扩增产物的电泳。HAART对6种疑似牙周病原体检测的影响研究人群中有32名患者正在接受HAART治疗。用药时间分为1~3个月、3~6个月和6个月以上。分析了HAART使用时间与6种细菌检测的关系。三个时间段的细菌检出率没有显著差异。下图显示了使用通用引物和我所设计的6个细菌特异性引物,通过巢式PCR检测从龈沟液中提取的细菌DNA。对于两个样本的DNA提取和纯度检测,使用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司,DP30）从唾液和龈沟液中提取DNA（具体步骤按照制造商提供的说明操作）。用核酸定量仪检测所得DNA纯度,od260/od280比值在1.7～2.0之间,表明DNA纯度良好,能够满足PCR检测的要求。龈沟液样本的选定牙齿位置为16、11、26、31、36和46。
　　14、所有受试者用1%H2O2溶液漱口
　　采样前,所有受试者用1%H2O2溶液漱口,用无菌棉球擦干,远离水分,将消毒过的纸尖轻轻插入牙周袋或龈沟底部30s,采样后将纸尖置于200°C?Zlite缓冲液,在-70℃下冷冻使用。DNA浓度=od260×50×稀释率。第二步是PCR反应:根据Siqueira等人报告的方法,它是针对牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、齿状密螺旋体、fusenia和中间普氏菌设计的,放线杆菌特异性引物用含0.5ug/ml溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳检测细菌,并用紫外凝胶成像系统观察和记录结果。唾液标本在1小时前禁食,收集唾液前用蒸馏水清洗。在6ul的收集过程中,使用无菌棉打开舌下和颊粘膜的腮腺导管。吸入唾液,将获得的样品置于含有1ml已灭菌巯基乙酸溶液的EP管中,并在-70°C下储存。在临床样品中,如果阳性对照获得相应的条带,但阴性对照没有条带,则记录样品中的微生物为阳性,否则就是负面的。每个细菌样本应进行两次测试。如果结果不一致,则应重复。可疑牙周病原体的检测在本研究中,基于细菌16srna的PCR用于检测和比较牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、牙本质密螺旋体、福赛尼、,在HIV感染者和对照者的唾液和龈沟液中检测到中间普氏杆菌和放线杆菌,发现除仅在HIV阴性对照组中检测到放线杆菌外,其他五种细菌在所有受试人群中的检测比例不同,不同部位的样品检测结果无显著差异。国外报道认为,疑似牙周病原体的检出率高于HIV阴性慢性牙周炎患者,一些非疑似牙周病原体更常在接受HAART的HIV阳性患者中发现,表明接受HAART的HIV感染者的牙周病原体种类发生了变化。
　　15、HIV感染者中六种细菌的检出率和不同CD4 T细胞计数之间没有显著差异
　　在这项研究中,六种细菌的检出率与HIV感染者中不同CD4T细胞计数之间没有统计学差异。研究表明,严重免疫抑制患者的粪肠球菌和核梭状芽胞杆菌检出率明显较高,表明免疫抑制有利于某些细菌的定植和过度繁殖。排除标准:3周内口服;病人不愿合作。统计各组致病菌的数量和检出率,比较检出率与吸烟、饮酒、CD4计数等因素的关系;计数数据采用X2检验。
　　16、在不同来源的口腔样本中检测到六种疑似牙周病原体
　　检测不同来源口腔标本中6种疑似牙周病原菌巢式PCR检测唾液和龈沟液标本中6种细菌。结果表明,在不同类型的标本中可以检测到不同的细菌。关于从不同来源的口腔标本中检测疑似牙周病原体的报道很多,但结论不同。Testa等人认为,唾液和龈沟液样本之间的牙周病原体检出率没有显著差异,但冯向辉等人发现,唾液样本在检测放线杆菌方面更准确。本研究未发现HAART对六种观察到的细菌的检测有影响,是否与观察时间短有关尚待确定。细菌检测与其他因素的关系本研究发现,不同吸烟程度的人群中间普氏菌的检出率存在统计学差异。在重度吸烟人群中,中间普氏菌的检出率显著降低,但未发现两者之间存在相关性
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