核心词：宁波牙科医院 人 牙周 细胞 压力 作用 Hif alpha Rankl Opg 变化 
　　牙周膜细胞常规培养于含20%胎牛血清的DMEM中。因此,将该基因重复三次,并取结果的平均值。采用相对定量法将目标基因设定为1△计算机断层扫描。通过比较压力组和对照组获得相对定量值。结果压缩后的人牙周膜细胞微球概况:图1显示,构建的人牙周膜细胞微球约为1mm球状,压缩组与对照组无显著差异。如上所述,异常机械压力可能上调人牙周膜细胞HIF-1α和RANKL,抑制OPG表达,促进破骨细胞功能,这可能是晚期牙周炎牙槽骨吸收的原因之一,其具体机制有待进一步研究。约80%的细胞融合后,消化并传代0.25%的胰蛋白酶。每孔2×106P3代人牙周膜细胞在完全培养基中悬浮在100细胞μL中,细胞不能很好地粘附在琼脂糖上或生长在琼脂糖中。每天将琼脂糖溶液更换50次μl。1周后,细胞将自行聚集形成人牙周膜细胞微球。
　　1、人牙周膜细胞受压后HIF-1α和RANKL/OPG mRNA表达
　　加压后人牙周膜细胞中HIF-1α和RANKL/OPG的MRNA表达:人牙周膜细胞微球在持续加压2MPa后,4h0HIF-1αRNA水平显著上调,约为对照组的2.7倍。
　　2、本研究中
　　在本研究中,纯牙周膜细胞微球的三维培养和加压装置与体外单层培养相比具有一定的优势,但不能用于研究牙周膜细胞与破骨细胞的共培养,这与blomen等人的方法不同,牙周膜细胞微球加压条件培养基可在体外模拟牙周膜细胞分泌因子对破骨细胞功能的影响,有待进一步研究。利用高密度细胞在非贴壁琼脂孔中形成无支架三维细胞块已被用于软骨和纤维软骨的组织工程。本研究采用高密度人牙周膜细胞微球,观察压力对HIF-1α和RANKL/OPG的影响,模拟过度咬合力对牙槽骨改建中牙周膜细胞的影响。人牙周膜细胞微球的构建和加压:按照Johns等人的方法,先将灭菌融化的2%琼脂糖注入24孔板的孔中,然后贴上直径为245mm×高10mm的不锈钢圆筒盖板,适用于24孔。室温下约1H形成琼脂糖凝胶,分离带不锈钢圆筒的24孔板盖,形成24孔直径5mm。×10mm高的琼脂孔,用完整培养基饱和,以取代琼脂糖中的PBS。
　　3、并促进人牙周膜细胞分泌的促进破骨细胞的因子的发育
　　讨论本研究结果表明,持续0.2MPa的压力会增加HIF-1α和RANKL的mRNA表达,抑制opgmrna的表达,从而增加RANKL/opgmrna的比例,使人牙周膜细胞分泌的因子向促进破骨细胞方向发展。最近的体外报告基因实验表明HIF-1α可直接上调RANKL,进一步提示HIF-1α转录因子可能通过调节RANKL的分泌而影响破骨细胞的活性。牙周炎是口腔疾病中的常见病。牙槽骨吸收是其主要临床表现之一。在严重的情况下,它会导致牙齿松动或脱落。利用P3代人牙周膜细胞构建细胞微球。目的基因的引物序列如下:HIF-1alpha上游引物:GCTGGCCCCAGCCTGGAG,HIF-1alpha下游引物:GAGTGAGGGTCAGCTAC;RANKL上游引物:CGTTGGATCACATCAG,RANKL下游引物:GTACCAAGAGACACTAC;OPG上游引物:cactactacagcacgctgg,OPG下游引物:actctatctcaggtagcgcc;GAPDH上游引物:GTCTTCACACATGGAGAAG,GAPDH下游引物:GTTGTCATGGATGCTTGGC。这与本研究的结果是一致的。0.2MPa可能代表过度咬合力,改变人牙周膜细胞微球的内部环境,影响HIF-1α的上调,提示其可能与促进RANKL表达增加有关。RANKL和OPG之间的平衡在破骨细胞的形成过程中起着重要作用。RANKL作为一种分泌因子,与破骨细胞前体细胞或破骨细胞膜上表达的rank受体结合,诱导破骨细胞分化、成熟和破骨细胞功能,而OPG是一种与RANKL结合的分泌性假受体,与RANKL结合抑制破骨细胞活性。将制备的人牙周膜细胞微球随机分为两组:加压组静置0.2MPa4h,对照组静置4h。除不加力外,其他培养条件与压力组相同。加力后进行一般观察,每组4个样本。
　　4、RANKL/OPG比值的升高表明
　　RANKL/OPG比值的升高表明0.2MPa的持续压力使人牙周膜细胞分泌的因子向破骨细胞方向发展。HIF-1alpha,即缺氧诱导因子-1alpha,在体内发现过度机械刺激会增加软骨细胞中HIF-1alpha的表达,并在体外机械力作用下增加肌腱成纤维细胞中HIF-1alpha的表达。本研究发现0.2MPa持续压力可促进RANKL表达和OPG表达,有利于破骨细胞的形成,这与大部分体外机械刺激牙周膜细胞的结论一致,宁波牙科医院可能是压力过大的原因,而其他研究人员发现,适当的机械刺激也能抑制牙周膜细胞破骨细胞的分泌。材料与方法人牙周膜细胞的分离与培养:按照参考方法,在无菌条件下,对健康男性正畸拔牙所提取的二尖牙根面上1/3的牙周膜进行刮除,采用组织块酶消化法获得人牙周膜原代细胞。实时定量RT-PCR检测HIF-1alpha和RANKL/OPG的表达:用Trizol试剂盒从人牙周膜细胞微球中提取总RNA,并根据primescriptrrtmastermix逆转录试剂盒逆转录为cDNA。根据PCRsybrrpremixextaqtmii试剂盒,应用生物系统7500PCR系统进行实时定量RT-PCR。
　　5、体内外实验表明
　　体内外实验表明,牙周膜细胞分泌的RANKL/OPG比值升高可能与牙周炎密切相关。咬合创伤往往是牙周炎的协同致病因素。过度咬合力导致牙槽骨吸收。体外实验也表明,人牙周膜细胞能够感知机械信号并调节RANKL/OPG的表达。注射器移动压缩空气通过活塞产生静水压力,作用于人牙周膜细胞微球。加压后,人牙周膜细胞的RANKLmRNA也显著上调,而opgmrna则略有下降。因此,压缩组反映破骨细胞功能的RANKL/opgmrna水平比率显著增加,约为对照组的2.2倍。牙槽骨严重吸收是晚期牙周炎的主要表现,牙周膜细胞分泌的RANKL/OPG是调节破骨细胞功能的一对重要因素。HIF-1α是细胞感受缺氧的重要转录因子。外部机械信号也可以改变其表达。最近的研究表明HIF-1α可以直接诱导RANKL的表达。压力装置采用任丽玲等增压系统。
　　6、将人牙周膜细胞微球置于添加有完整培养基的5ml注射器中
　　将人牙周膜细胞微球置于添加有完整培养基的5ml注射器中。注射器固定在超净工作台的加压装置上,并保持在37℃恒温水浴中。统计分析:数据以X±s表示,spss160为单因素方差分析,选择α=0.05
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